1971年Eigen首先提出RNA分子的复制机制，其特点是复制的逼真度低。因此，在复制过程中可产生准种（puasispecies）。所谓准种，即是一组自身复制的分子，它们彼此不同，但又密切相关。准种的演变是从一个原始的特定病毒序开始的，该病毒的每一轮复制均导致变异株的出现。因此，在任何时点，某病毒群（viral population）总是由常见的代表性序列即主序列（master sepuence）和同一组不同的但又密切相关和序列（变异株）所组成。所有这些相关的序列（变异株），不管其所占比例如何，均被认为是一群复制体（replicon）,表现为动态的基因相互作用（dynamic genetic interaction）。当环境发生改变时，在原病毒群中已存在的各种变异株，以及在复制过程中新生代的变异株中，将被选择出最适应于新环境的变异株。尔后，被选择出的变异株又面临新环境的变化。为了其子代能继续复制，将再次被选择出适应新环境的变异株。如此周而复始，不断形成新的病毒群（即准种）。
HCV为单股正链RNA病毒，其复制机制与此相同，在感染过程中也可出现新的准种。
最近发现，不仅RNA病毒，DNA病毒如乙型肝炎病毒（HBV）等也存在准种现象。但由于HCV的突变率高于HBV，因此其准种现象较HBV更为明显。 无论是HCV抑或HBV，在感染过程中，由于病毒的复制和突变，可形成众多代次的各种变异株。如逃避免疫应答的变异株、逃避疫苗的变异株，耐抗病毒治疗的变异株和改变细胞亲和力的变异株等，它们在病毒持续性感染中起重要作用。因此，准种的研究引起了国外学者的关注。
二、准种的特性
（一） 主序列（master sepuence）：即初次感染时病毒主要序列。
（二） 一致性序列（consensus sepuence）：即与主序列不同但又密切相关的序列。
（三） 准种的复杂性（complexity of puasispecies）：包括不同变异株的百分比（即各变异株的频率）和变异株的多形性（polynorphism）或变异株谱（mutant spoectrum）。前乾是指各变异株在该病毒群中所占比例；后者表示多形性位点数，即变异位点数除以片估长度乘以所分析的克降数。。
准种的复杂性对区别两个准种群的特点具有重要意义，特别是当两个准种群的优势序列相同时尤为重要。A和B2个HCV分离株的准种群，两者的优势序列相同，但B分离株的准种复杂性明显高于A分离株。准种的复杂性与准种存的时间、初次感染时的病毒群数量、所分析基因区突变率及不同变异株的复制率有关。准种的复杂性提示该病毒群系近期感染。如在初次感染或再次感染时病毒群数量很大（如输血或持续应用血制品），则准种的复杂性高；如病人只感染一个或少数几个复制病毒，则准种的复杂性低。病毒各基区的突变率高或变异株的复制率高，则准种的复杂性也高。
（四）突变率（rate of fixation of mutation）：即基因复制时发生变异的频率，它取决于基因复制的逼真度、参与病毒复制的酶及环境条件（如细胞间的核苷酸浓度以及存在致突因子等）。RNA病毒的平均突变率为10-3～10-5每个基因组/每一复制循环。由于RNA病毒的复制率高。因此，只需若干个复制循环即可形成由多各种变异株组成的准种群。 由于HCV缺乏合适的细胞培养系统，因此，难以确定每一个复制循环的突变率。但是，通过对HCV感染者的随访研究，可了解HCV的平均突变率。例如：通过比较8～13年间从人和黑猩猩分离的HCV优势序列，估计HCV基因组的平均突变率为1.44～1.92×10-3/每一个基因位点/每年。此突变率与引起持续性感染的其他病毒（HIV、足口病病毒等）相似。
上述突变率是通过对间隔多年后所获得的HCV克隆核苷酸全序列计算出来的。但在，在基因组内各区域的突变率是不同的。如果是比较于短期内获得的克隆序列，而且是某一特定的基因区，则其突变率可能不同。这在HCV E2区的HVR1尤为明显，因该区突变率最高。此外，E1、E2和NS2区的突变率也较高，较C区和NS3区高5倍。
病毒突变可分为同义突变（synonymous mutation）和非同义突变（non-synonymous mutation）。所谓同义突变，即许多位点变并不改变所编码的氨基酸，对表型（phenotype）无影响。非同义突变可改变其编码的氨基酸，并导致表型的改变，从而影响病毒的毒力及其对抗病毒药物的抵抗力等。HCV E1 和E2区点突变所引起的氨基酸突变率最高，但NS2A区突变常不引起氨基酸的改变。
三、准种的分析方法
最早分析准种的方法是用RNA"指纹图法"（RNA "finger-priting"）,但是，由于HCV RNA在血清中的浓度很低，因此，不能直接用RNA"指纹图法"检测，需用RT-RCR扩增后才能分析。
目前分析HCV准种的方法有以下4种：
（一） HVC克隆RT-PCR产物序列测定法（Sequencing of clonecd RT-PCR products）：将HCV RNA RT-PCR产物克降至大肠杆菌，然后从10-20个独立克隆（每个克隆代表一个病毒基因组）分离DNA，并测定其序列。
（二） 单股构象多形性分析法（Single-strand conformation polymorphism,SSSP）：应用非对称PCR获得单股DNA，然后分析单股DNA在非变性凝胶中的电泳速度。在特定条件下，DNA片段的电泳速度由其结构所决定。病毒基因组的每一个变异均导致结构的改变。因此，在电泳时，各变异株的电泳方式不同。
（三） 温度梯度凝胶电泳法（Temperature-gradient gel electrophoresis,TGGE）:HCV RNA经RT-PCR扩增后，获得DNA链，其间形成杂交子（hybrids），此种杂交子也称异种复制子（heteroduplexes），它是由一个野毒株序列和一个或二个变异株序列所组成，这些杂交子含有错配子（位于DNA链的错配位点）。由于错配导致杂交子的稳定性下降，因此，在温度梯度凝胶电泳时，杂交子在特定的位点融化。不同变异株在RT-PCR过程中形成不同的杂交子，而不同杂交子的稳定性各不相同，从而导致各变异株不同的电泳特点。
（四） 凝胶转移分析法（Gel-shift analysis,GSA）：PCR产物与原来标记的特定序列之间可形成异种复制子。本法是分析在非变性凝胶中，由于异种复制子存在错配，从而导致其电泳速度较同种复制子迟缓，此种迟缓与其序列差异大小有关，其电泳带数也与异源性高低有关。
在丙型肝炎病人的每毫升血清中，存在成千上万个不同序列的HCV变异株，现有准种分析方法只能提供较为常见的变异株分布资料。图5所示丙型肝炎病人血清中变异株的分布情况。左图表示A病毒群中24个变异株的分布情况；右图表示B病毒群中34个变异株的分布情况。由图5可见，测序的克隆数可影响对该准种的结论。如例1只测定一个克隆序列，所测到的只是主序列，无法提供该准种的复杂性资料。例2测定了10个克降的序列，则该2个准种群中占6%以上的变异株均可测到。例3测定了20个克隆序列，则可获得较为可靠的准种群的资料，但仍不能提供少见准种的资料。因此，现有的准种分析方法尚需进一步提高。
四．准种的临床意义
（一） 准种与持续性感染 HCV不整合于宿主的基因组，但常引起持续性感染。HCV持续性感染并不局限于HLA-DR单型病人，提示存在其他的致病机理。
关于HCV持续性感染的致病机理目前有以下几种解释：
1、 病毒致细胞病变的能力下降：（1）HCV在复制过程中不断产生有缺陷的变异株，这些有缺陷的变异株在细胞内复制可影响野毒株的复制，因此，总的病毒产量减少，从而降低了病毒的致细胞病变能力，有利于病毒的持续感染；（2）产生致细胞病变力低的变异株；（3）产生复制率低的突变株；（4）细胞与病毒共同进化（cell and virus co-evolution）使肝细胞产生对HCV致细胞病变的耐受力，从而导致HCV的持续性感染。
2、 产生逃避宿主免疫应答的变异株：宿主对HCV的免疫应答是主动的可限制病毒的产生。用HCV合成肽反复刺激HCV慢性感染病人的外周血单核细胞（PBMCs），发现50%病人的PBMCs对多种HCV多肽有特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）应答。在感染的肝组织中存在CD8介导的、能有效清除感染HCV的肝细胞所必需的组分。肝脏HCV特异性CTL活性阳性的病人，其ALT水平明显升高，淋巴结内CD8细胞数增加，病毒滴度较低，组织学活动度较高，提示HCV特异性CTL通过调节病毒复制，在宿营主防御中起重要作用。HCV基因组的中和抗体或CTL表位突变可逃避宿主免疫应答，并导致持续感染。Weiner等从一只HCV持续性感染的黑猩猩中发现，在NS3解旋酶区保守的CTL表位发生单个氨基酸突变后，即不能被野毒株的CTL所识别。
此外，逃避体液免疫应答的变异株也有报道，它可能是HCV持续感染的另一个重要原因。免疫抑制的病人如肝移植第一阶段的病人、合并感染HIV病人、CD4数量减少的病人以及免疫球蛋白缺乏症病人，其HCV准种的复杂性低，也支持宿主免疫应答与HCV持续性感染的关系。
3、 病毒的可塑性（viral plasticity）：病毒具有可塑性，为适应环境改变而不断变异，不断选择，产生适应新环境的变异株并继续复制，从而导致持续性感染。
（二） 准种与肝损害 一些研究提示，HCV可能有直接致细胞病变作用：（1）急性和慢性丙型肝炎病人的肝组织学提示HCV有直接致肝细胞损伤作用；（2）用原位杂交法检测感染HCV的黑猩猩肝组织，可测到负链HCVRNA，并与血清丙氨酸转氨酶（ALT）升高相一致；（3）一些体外细胞系统也证明，HCV复制可起细胞裂解；（4）合并感染HCV及免疫球蛋白缺乏症病人的HCV感染较为严重。（5）Hayashi等报告，HCV核心区和包膜区准种群的异源性与肝组织学严重程度有关；（6）Yuki等报告，HCV准种的异源性与ALT水平高低有关。
但是，也不能排除宿主免疫应答在肝损伤及控制病毒复制中的作用。
（三） 准种对干扰素治疗的应答 Okada等首先报告HCV HVR-1区的变异程度与对干扰素的应答有关。尔后，一些研究证实，准种的复杂性与对干扰的应答有关，含HCV准种复杂性高的病人对干扰素治疗应答差或无应答。Poliak等认为，对干扰素治疗有无应答取决于变异株间的差异程度，而不是变异株的变量。但一些学者报告，对干扰素有应答和无应答的两组病人，在治疗前其准种的复杂性并无差异。Enomoto等报告，在1b型HCV NS5区有一个干扰素敏感性决定区（interferon sensitivity-determining region,ISDR）当该区发生变异时，可产生耐干扰的变异株。但Squadrito等在分析干扰素治疗前后的准种群时，未发现此种变异株，认为ISDR区变异可能与治疗的应答无关。
北京大学基础医学院微生物学系 庄辉 | |
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