丙型肝炎病毒高变区变异和保护性免疫研究近况

闵峰 郝飞 王宇明

    丙型肝炎病毒（HCV）感染呈世界性分布，据估计现全球HCV感染者达1.3亿。HCV感染人体后极易慢性化，且与肝硬化肝癌关系密切，对人类健康危害甚大，HCV包膜糖蛋白高变区一直是人们关注的焦点。一方面，高变区存在中和抗原表位，此表位能诱导机体产生保护性抗体，并阻止HCV感染；另一方面高变区呈高度变异，易发生抗原漂移，逃避机体免疫系统识别，使其能在宿主细胞持续复制，而呈慢性化发展，本文就此作一综述。

   一、HCV包膜糖蛋白高变区变异及其机制

1. HCV包膜糖蛋白高变区基因结构及其变异

       丙型肝炎病毒颗粒的直径为55-65nm，有一个立方体蛋白外壳，外面包裹着脂质外膜，外膜中有E1、E2两种糖蛋白形成的二聚体。HCV包膜糖蛋白基因位于核心蛋白区（C区）之后，包膜E1和E2／NS1区两部位。目前认为E1及E2／NS1两种糖蛋白分别位于基因核苷酸序列的第915－1490位和1492－2768位，对应的氨基酸的位点分别是E1(191－383aa)，E2／NS1(384-473aa)。E2／NS1区基因C端相对保守，N端变异较大，N端有两个高变区(hypervariable region)即HVR1(384-473aa)和HVR2(474-480aa)。
       研究发现几乎所有的HCV分离株高变区（HVE1）的变异均明显高于其它区域，而HVR1仅有81个核苷酸，占HCV全部基因的0.8%，而变异的核苷酸占HCV全部变异核苷酸的4％，变异氨基酸占5％。Okamoto等^[1]在回顾性研究中，对一只HCV－J4感染的黑猩猩长达8.2年的随访，并对HCV cDNA全序列分析，发现HCV基因结构存在着基因漂移，其中E2／NS1区中的HVR1变化最明显。Doorn等^[2]对7只HCV感染的黑猩猩作基因结构分析也得到类似的结果。Kato等^[3]对2例慢性HCV感染者随访并动态观察其基因结构，发现HVR1部位氨基酸连续变异，变异率为0.5-1.7 aa/月。随后Hohne等^[4]对一慢性HCV感染者长达10年的随访，发现包膜蛋白的基因变异率在0.9-5.2×10^-3／每核苷酸／每年，而HVR1的变异率达1.5×10^-2／每核苷酸／每年。有关HVR2区研究甚少，可能是由于有些病毒株没有HVR2区等缘故。
       尽管HVR1变异较大，但HVR1内也可见高度保守的氨基酸位点，如第385位苏氨酸，第406位谷氨酸，第413位亮氨酸等，它们对维持HVR1蛋白的空间结构可能起到一定的稳定作用。

2. HCV包膜糖蛋白高变区变异的机制
       HCV和其它RNA病毒一样，在无免疫压力的作用下也会发生变异，其原因可能是RNA病毒的遗传变异，遗传变异是两个不同过程的结果，第一过程是产生一代突变基因组，第二过程是突变后竞争分级。然而，目前普遍公认HCV变异的最主要原因是免疫压力选择所致。
       Kumar等^[5]对一例g -球蛋白缺乏症合并HCV感染的肝硬化患者作长期随访和动态观察HVR1序列变化。发现当HCV处在一个缺乏体液免疫压力的自然变异环境中，而HVR1在2.5年内没有一个核苷酸发生变异，此研究证实了HVR1的变异是由于免疫压力选择所致。另外Weriner等^[6]报道了新生儿HVR1的核苷酸序列也稳定不变，从而，也说明了免疫压力在HV1变异中起主要作用。Doorn等^[7]对6只黑猩猩接种含有HCV HVR1序列相同基因型1b株后，观察HVR1序列变化与特异性免疫反应的关系。发现呈慢性感染的3只黑猩猩中有2只出现HVR1序列，虽可检出HVR1抗体，但HVR1序列一直存在变化，而另1只黑猩猩的HVR1序列维持6年以上仍然不变，此间检测不出相关的HVR1抗体；但在接种后7年，产生了抗HVR1，且与HVR1序列改变同时存在。该结果有力支持HVR1可通过免疫选择作用而引起HVR1序列变异。Yuki等^[8]对38例慢性HCV感染者长达218月随访，并通过单链构象多态性分析(SSCP)其HVR1序列变化情况，发现HVR1序列变化与ALT升高水平呈正相关（尤其与ALT升高的峰值），却与感染途径和感染时间无关联，但HCV慢性携带者（ALT正常，无临床症状）HVR1核苷酸序列无明显变化，ALT升高可能是宿主的免疫系统被激活，通过机体免疫反应驱除体内的病毒，而病毒为了适应其生存环境产生新的突变体，逃避机体免疫系统的识别，使其HVR1核苷酸序列发生变化。
       此外，有研究报道药物压力对HVR1序列变化也有选择作用。Okada等^[9]研究了6例慢性HCV感染者的HVR1的氨基酸异质性与干扰素（IFN）治疗反应的关系，其中3例病人经IFN-b治疗6个月后，血清中HCV－RNA转阴，且ALT有显著改善。并对病人血清中克隆的cDNA进行序列分析，病毒基因型异质性程度较小，HVR1的核苷酸和编码的氨基酸序列变化不大；而另3例对IFN－b治疗无反应的病人，其HVR1的核苷酸和编码的氨基酸序列出现显著变化。表明了HVR1基因的异质性的氨基酸变异程度与干扰素（IFN）治疗反应密切相关。Enomoto等^[10]采用PCR－SSCP分析技术，研究了HCV－HVR1核苷酸异质性与干扰素（IFN）治疗反应之间的关系。结果与Okada报道相一致。研究表明，干扰素（IFN）治疗期间药物压力参与了HVR1的变异。
       对于丙型肝炎，现普遍认为细胞介导的免疫损伤可能使HCV致肝脏病变的主要原因，由此看来HVR1不仅存在中和抗原表位，还可能有细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes, CTL)识别位点，可能是由于它在体液免疫和细胞免疫双重压力选择下出现变异株。HVR1的变异与免疫压力是互为因果，相互依存共同进化的结果，其最终是导致丙型肝炎的慢性化。

二、HCV包膜糖蛋白高变区与保护性免疫

1、HCV包膜糖蛋白高变区的中和抗在表位
    HCV gp70的高变区-1(HVR1)与HIV－I型的gp120 V3环相似，而HIV－I型的gp120 V3环含有诱导机体产生中和抗原表位，此表位产生抗体在体外能中和HIV感染。由此推测，位于HCVgp70中的HVR1可能含有中和抗原表位^[11,12]。通过分析发现，HVR1区确实存在中和性表位，但各家报道意见不一致。Weiner等^[11]经体外抗体－表位定位研究显示，有5个中和抗原表位，位于396-414氨基酸之间，并证实HVR1是体液反应的主要靶位。Kato等用体外转录翻译表达HVR1(27aa)融合蛋白与病人血清在体外作免疫沉淀反应，结果提示HVR1含有线性B细胞表位，位于394-404aa和397-407aa间，此表位能诱导机体产生特异性抗体，但有株特异性(isolate-specific)。Rosa等^[12]结合细胞荧光标记与流式细胞记数技术，建立了HCV E2蛋白与靶细胞中和结合定量分析检测系统，结果显示HCV E2区至少存在两个中和抗原表位，分别位于HVR1区和E2其它区域。Esumi等^[13]用相应重组蛋白／合成肽免疫鼠产生抗血清，在体外基于抗体－病毒相互作用，并通过免疫沉淀实验研究发现抗E2和抗HVR1能有效地捕获HCV，而且抗E2和抗HVR1能特异性凝集HCV，并指出免疫决定簇主要位于HVR1序列起始20个氨基酸间即384-403aa。另外对HVR1B细胞表位的描述还包括有400-409aa^[14], 398-410aa^[15], 399-405aa^[17]等。

2、抗HVR1体外阻断HCV感染的研究
    一般来说，清除病毒建立机体保护性免疫通常与针对病毒包膜蛋白上中和抗原表位的抗体产生有关，这种抗体既可阻止病毒对敏感细胞的吸附，又可增加细胞免疫对病毒的识别和清除作用。Shimizu等^[15]合成了与HCV－H77株HVR1区的相一致多肽（即390-414aa），免疫兔后获得抗血清在体外与H77／H90株混合后接种于HPB-Ma细胞，发现抗血清能中和同源性病毒株即H77，却不能中和异源性病毒株即H90株，而对照兔血清对H77株和H90株均无阻断作用，作者认为抗HVR1在体外确实能中和病毒并且有株的特异性。Zibert等^[17,18]用慢性HCV－AD78感染者血清在体外进行中和实验，此血清含有HVR1抗体，发现感染早期（感染后1年内）7份血清有5份血清能干扰病毒颗粒吸附到成人纤维细胞上，阻止病毒复制，而感染后期（感染后11年的血清）却不能阻止HCV－AD78感染。提示抗HVR1在体外确实能中和病毒感染，但不能排除其它抗体的参与。Rosa等^[12]用表达在哺乳动物细胞中重组蛋白E2，经纯化后免疫兔产生多克隆特异性抗E2血清，在体外进行中和结合实验，并通过定量分析评价E2中和作用，结果发现高效价抗E2能中和E2结合到靶细胞并阻止HCV感染，同时发现针对HCV－E2 HVR1特异性单克隆抗体也能部分中和E2结合靶细胞，提示抗E2和抗HVR1抗体在体外确实具有中和病毒作用。

3、抗HVR1在宿主体内保护作用研究
    大部分宿主在HCV感染后并不能产生稳定有效的免疫，也不能充分阻止新的变异株攻击，但临床和实验研究表明，初次感染HCV后机体可产生一定程度的保护性免疫，Prince等^[19]报道黑猩猩第二次受到病毒攻击时临床症状较第一次感染时轻，提示体内产生了针对病毒抗原的保护性免疫。Farci等^[20]用HCV－H77株HVR1的两条合成肽(A: 390-414aa B: 384-414aa)免疫接种兔后得到抗HVR1的超免疫血清，然后给5只黑猩猩接种抗血清与不同相似株H77／H99株混合物，结果显示抗HVR1仅对同源的H77株攻击有免疫保护作用，而对异源性病毒株H90株无免疫保护作用。因此作者认为中和抗体攻击的靶位是E2／NS1的HVR1，但宿主产生的这一保护性免疫应答较弱，而且抗HVR1的中和作用有病毒株特异性。最近Esumi等^[21]以HCV－N株重组蛋白E1(396-330aa), E2(396-683aa)和HCV＃6不同分离株相一致合成肽即HCV＃6E1肽，HCV＃6 HVR1肽，HCV＃6 HVR2肽免疫接种黑猩猩（年龄5周岁，命名为228号）4次，免疫后228号产生的免疫反应主要是针对HCV－N的E1，E2蛋白，而针对HCV＃6的抗HVR1反应较弱。免疫4次后并静脉接种HCV＃6(10CID50)，第2周出现病毒血症，持续18周，但ALT正常；对照组220号黑猩猩，接种后第1周出现ALT升高，并伴有病毒血症持续15周。结果表明用异源性E1，E2蛋白免疫动物对HCV＃6没有免疫保护作用，HCV＃6相似株在免疫动物中极可感染。为了增强黑猩猩对抗HVR1的反应，Esumi等再次作免疫接种感染实验，待第1次免疫接种感染的病毒血症消失后5个月，加大HVR1肽的剂量再次免疫228号，当抗E1，E2（针对HCV－V）和抗HVR1（针对HCV＃6）达到高峰时，再接种HCV＃6(10CID50)，发现228号获得了免疫保护（既没有病毒血症，又没有ALT升高现象）。第2次攻击后，抗HVR1即刻出现，提示抗HVR1与免疫保护有关。为了进一步证实第2次攻击获得保护主要是由于免疫接种产生，于是当228号血清中所有抗体水平降低到最低时，再次用HCV＃6(10CID50)攻击228号，接种后2周内，血清中HCV RNA阳性，表明针对同源性HVR1肽产生高反应的抗体是清除病毒的主要抗体。同时将第2次攻击前3天的228号血清（此血清含有高滴度抗E1，E2，HVR1）在体外与HCV＃6混合4℃孵育过夜，以此混合物静脉接种于229号黑猩猩，发现接种后6周内未出现感染成功的迹象，而对照组在1周出现HCV RNA阳性，但ALT正常。这些结果表明了用异源性的重组蛋白E1，E2，再加上同源性HVR1肽共同免疫动物能产生免疫保护作用，抗HVR1在免疫保护中起着重要作用，而E2可能也参与抑制病毒的复制，此外也不能排除CTL在免疫保护中作用。此外，Zibert等^[22]对51例HCV感染者血清中出现的抗HVR1进行动态分析，发现感染早期（1年内）出现的抗HVR1，呈急性自限性感染，提示感染早期（1年内）出现的抗HVR1可作为疾病预后判断的指标。

三、存在的问题和展望

    HCV E区基因及其编码的包膜糖蛋白是HCV疫苗研究的重点和关键。研究表明HCV在整个基因组皆存在变异，尤其E2 HVR1是一个快速突变的蛋白区，易发生抗原漂移，能逃避宿主的免疫攻击。目前HCV慢性化的过程实际就是HCV HVR1变异株产生的速度大于宿主免疫清除能力的过程。HVR1是机体免疫系统攻击的主要靶位，但此表位诱导机体产生的中和性抗体仅能和最近HCV株发生中和反应，对其它变异株无或存在部分交叉反应，加之HCV有众多基因型和准种形式存在，对其保护作用很难作出正确评价，也是人们争论的焦点。我们可以依据HCV包膜糖蛋白含有中和抗原表位这种特性，通过噬菌体肽库筛选与HVR1抗体特异性反应的模拟肽，此模拟肽含有不同株高度保守的位点或多个株多种变异位点，并且能确实替代HVR1区抗原表位诱导机体产生针对多种HCV株的免疫反应，可作为探索预防性疫苗研制的一种方向；另一方面是如何克服HVR1变异的作用机制，寻找一些保守的表位以便研制多价疫苗，或者采用激发细胞免疫和体液免疫相结合的方法来研制混合疫苗。随着生物学技术飞速发展，人们对HCV包膜糖蛋白高变区的认识逐步加深，不久将会研制一种广泛的有效的疫苗预防HCV感染。

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作者单位：400038 重庆，第三军医大学西南医院感染科